Fue una de las mujeres de más talento de su época, y aunque perdió un ojo a causa de un entrenamiento de esgrima, se la estimaba como una de las damas más hermosas de la corte española. Entre las teorías que se barajan sobre la pérdida de su ojo derecho, la más respaldada es la que asegura que la princesa fue dañada por la punta de un florete manejado por un paje durante su infancia. Pero este dato no es claro, quizá no fuese tuerta sino bizca, aunque hay pocos datos que mencionen dicho defecto físico. En cualquier caso, su defecto no restaba belleza a su rostro; su carácter altivo y su amor por el lujo se convirtieron en su mejor etiqueta de presentación y ejerció una gran influencia en la corte.
No se le conocen andanzas ni problemas, por lo que su vida matrimonial fue estable del que nacieron diez hijos, Diego, Ana, Rodrigo, Pedro, Diego, Ruy, Fernando, María de Mendoza y María de Silva y Ana.
Debido a su alta posición, mantenía relaciones cercanas con el primero príncipe y luego rey Felipe II, lo que animó a varios a catalogarla como amante del rey, principalmente durante el matrimonio de éste con la joven Isabel de Valois, de la cual fue amiga. Lo que sí parece seguro es que, una vez viuda (1573) sostuvo relaciones con Antonio Pérez, secretario del rey. Antonio era seis años mayor que ella y no se sabe realmente si lo suyo fue simplemente una cuestión de amor, de política o de búsqueda de un apoyo que le faltaba desde que muriera su marido. Estas relaciones fueron descubiertas por Juan de Escobedo, secretario de don Juan de Austria, además de que mantenía contactos con los rebeldes holandeses. Antonio Pérez, temeroso de que revelase el secreto, la denunció ante el rey de graves manejos políticos y Escobedo apareció muerto a estocadas, de lo que la opinión pública acusó a Pérez, pero pasó un año hasta que el rey dispuso su detención. Los motivos de la intriga que llevaron al asesinato de Escobedo y a la caída de la princesa no son claros. Parece probable, junto a la posible revelación de la relación amorosa entre Ana y Antonio Pérez, también la existencia de otros motivos, como una intriga compleja de ambos acerca de la sucesión al trono vacante de Portugal y contra don Juan de Austria en su intento de casarse con María Estuardo.
La princesa fue encerrada por Felipe II en 1579, primero en el Torreón de Pinto, luego en la fortaleza de Santorcaz y privada de la tutela de sus hijos y de la administración de sus bienes, para ser trasladada en 1581 a su Palacio Ducal de Pastrana, donde morirá atendida por su hija menor Ana de Silva (llamada Ana como la hija mayor de la Princesa, se haría monja luego) y tres criadas. Es muy conocido en dicho palacio el balcón enrejado que da a la plaza de la Hora, donde se asomaba la princesa melancólica. Tras la fuga de Antonio Pérez a Aragón en 1590, Felipe II mandó poner rejas en puertas y ventanas del Palacio Ducal.
No está tampoco muy claro el porqué de la actitud cruel de Felipe II para con Ana, quien en sus cartas llamaba "primo" al monarca y le pedía en una de ellas "que la protegiese como caballero". Felipe II se referiría a ella como "la hembra". Es curioso que mientras la actitud de Felipe hacia Ana era dura y desproporcionada, siempre protegió y cuidó de los hijos de ésta y su antiguo amigo Ruy. Felipe II nombró un administrador de sus bienes y más adelante llevaría las cuentas su hijo Fray Pedro ante la ausencia de sus hermanos.
Falleció en dicha localidad en 1592. Ana y Ruy están enterrados juntos en la Colegiata de Pastrana.
Julia Ormond rueda La Conjura de El Escorial en Toledo.
